紫外可見分光光度計是一種廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物化學(xué)、制藥和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域的分析儀器，能夠快速、簡便地評估樣品純度。本文將詳細(xì)介紹利用紫外可見分光光度計進(jìn)行樣品純度檢測的原理、方法和注意事項。
一、檢測原理
紫外可見分光光度法基于樣品分子對特定波長紫外或可見光的吸收特性。當(dāng)光通過樣品溶液時，樣品中的分子會吸收特定波長的光，導(dǎo)致透射光強(qiáng)度減弱。根據(jù)朗伯-比爾定律，吸光度(A)與樣品濃度(c)成正比：
A=εcl
其中ε為摩爾吸光系數(shù)，l為光程長度(通常為1cm)。純度檢測主要利用這一原理，通過比較樣品在特定波長下的吸光度與標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，或通過分析吸收光譜特征來判斷樣品純度。
二、操作步驟
1.樣品準(zhǔn)備：將待測樣品溶解于適當(dāng)溶劑中，濃度通常控制在使吸光度在0.1-1.0范圍內(nèi)(此范圍內(nèi)儀器響應(yīng)最線性)。常用溶劑包括水、甲醇、乙腈等，需確保溶劑在測定波長范圍內(nèi)無明顯吸收。
2.儀器預(yù)熱與校準(zhǔn)：打開光度計電源，預(yù)熱15-30分鐘。用純?nèi)軇┳鳛榭瞻走M(jìn)行基線校正，確保儀器處于穩(wěn)定狀態(tài)。
3.光譜掃描：設(shè)置合適的波長范圍(通常200-800nm)，對樣品溶液進(jìn)行全波長掃描，獲取吸收光譜。
4.數(shù)據(jù)分析：
-觀察吸收峰位置和形狀是否與標(biāo)準(zhǔn)品一致
-計算特定波長下的吸光度比值，判斷是否存在雜質(zhì)
-通過摩爾吸光系數(shù)計算樣品濃度，評估純度
5.定量分析：在最大吸收波長處測定吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線或已知的摩爾吸光系數(shù)計算樣品濃度和純度。
三、純度評估方法
1.吸收峰比值法：純化合物在紫外可見區(qū)的吸收峰位置和相對強(qiáng)度是特定的。通過比較樣品在不同波長下的吸光度比值與標(biāo)準(zhǔn)品的差異，可判斷純度。例如，核酸純度常通過A260/A280比值評估。
2.光譜形狀分析：純物質(zhì)的光譜曲線平滑，特征峰明顯。雜質(zhì)的存在常導(dǎo)致基線抬高、峰形不對稱或出現(xiàn)額外小峰。
3.摩爾吸光系數(shù)法：對于已知ε值的化合物，通過測定吸光度可計算濃度，進(jìn)而評估純度。需準(zhǔn)確知道樣品分子量和光程長度。
4.導(dǎo)數(shù)光譜法：利用高階導(dǎo)數(shù)光譜增強(qiáng)細(xì)微光譜差異的識別，提高對微量雜質(zhì)的檢測靈敏度。
四、注意事項
1.溶劑選擇：確保溶劑在測定波長范圍內(nèi)無顯著吸收，且能充分溶解樣品。常用溶劑截止波長：水(190nm)、乙腈(190nm)、甲醇(205nm)、氯仿(245nm)。
2.濃度控制：吸光度最好在0.1-1.0范圍內(nèi)，過高會導(dǎo)致偏離比爾定律，過低則信噪比差。可通過稀釋或濃縮調(diào)整。
3.比色皿清潔：使用前后用適當(dāng)溶劑清洗比色皿，避免刮傷光學(xué)面。指紋或污漬會嚴(yán)重影響測量結(jié)果。
4.溫度控制：某些化合物的吸收特性受溫度影響明顯，必要時使用恒溫比色皿架。
5.儀器性能驗證：定期用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(如重鉻酸鉀溶液)驗證儀器波長準(zhǔn)確性和吸光度準(zhǔn)確性。
五、應(yīng)用實(shí)例
1.蛋白質(zhì)純度檢測：通過A280/A260比值評估蛋白質(zhì)樣品中核酸污染程度，純蛋白比值約1.8。
2.DNA/RNA純度檢測：純DNA的A260/A280比值約1.8，RNA約2.0，偏離此值表明可能有蛋白質(zhì)或酚類污染。
3.藥物純度檢測：比較樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸收光譜的一致性，檢測可能存在的雜質(zhì)或降解產(chǎn)物。
紫外可見分光光度法作為快速、簡便的純度檢測手段，雖不能替代色譜等分離分析方法，但在日常質(zhì)量控制、實(shí)驗過程監(jiān)測中具有重要價值。結(jié)合其他分析技術(shù)，可對樣品純度做出更全面評估。
