以下是關(guān)于超微量分光光度計(jì)校準(zhǔn)方式的詳細(xì)解析，涵蓋核心步驟、技術(shù)要點(diǎn)及注意事項(xiàng)：
一、儀器自校準(zhǔn)功能
1. 原理與目的
超微量分光光度計(jì)通常內(nèi)置自校準(zhǔn)程序，通過儀器自帶的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)(如暗電流校正、光源強(qiáng)度補(bǔ)償)對光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行初始化標(biāo)定。自校準(zhǔn)可快速修正電子漂移、光源老化等引起的偏差，是日常維護(hù)的基礎(chǔ)步驟。
2. 操作步驟
- 進(jìn)入儀器菜單，選擇“自校準(zhǔn)”或“性能驗(yàn)證”模式；
- 按提示執(zhí)行空白測量(如空氣或純水作為參比)；
- 儀器自動(dòng)調(diào)整至出廠預(yù)設(shè)參數(shù)，并生成校準(zhǔn)報(bào)告。
3. 局限性
自校準(zhǔn)無法糾正波長偏移或光路物理變化(如光纖位移)，需結(jié)合其他方法定期驗(yàn)證。
二、外部標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)
1. 適用場景
當(dāng)儀器用于定量分析(如核酸、蛋白濃度測定)時(shí)，需通過標(biāo)準(zhǔn)溶液驗(yàn)證吸光度準(zhǔn)確性。常用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包括：
- 霍姆斯緩沖液(Horseradish Peroxidase, HRP)：用于紫外區(qū)(230 nm、260 nm、280 nm)校準(zhǔn)；
- 中性密度濾光片：驗(yàn)證吸光度線性范圍(0-4 OD)；
- NIST追溯標(biāo)準(zhǔn)溶液(如重鉻酸鉀溶液)：用于多波長交叉驗(yàn)證。
2. 操作要點(diǎn)
- 液柱形成：超微量儀依賴基座檢測模式，需用移液槍精確滴加0.3-2 μL標(biāo)準(zhǔn)液，形成穩(wěn)定液柱(光程0.05-0.5 mm)；
- 多點(diǎn)校準(zhǔn)：在目標(biāo)波長(如260 nm測RNA)下測量不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算儀器線性相關(guān)系數(shù)(R²>0.995為合格)；
- 空白對照：使用同批次溶劑(如超純水)作為參比，避免溶劑雜質(zhì)干擾。
三、波長校準(zhǔn)
1. 必要性
波長準(zhǔn)確性直接影響定性分析(如特征吸收峰識(shí)別)。超微量儀的氙燈光源或LED光源可能發(fā)生波長漂移，需定期校驗(yàn)。
2. 校準(zhǔn)方法
- 汞燈特征譜線法：利用汞燈在253.6 nm、296.7 nm等處的尖銳吸收峰，對比儀器顯示波長與實(shí)際峰值偏差(應(yīng)<±1 nm)；
- Horia溶液法：通過鈥玻璃在可見光區(qū)的多條特征吸收峰(如486 nm、536 nm)進(jìn)行多點(diǎn)校準(zhǔn)；
- 軟件校準(zhǔn)：部分機(jī)型支持自動(dòng)掃描標(biāo)準(zhǔn)濾光片，通過算法修正波長偏移。
四、穩(wěn)定性與重復(fù)性檢測
1. 短期穩(wěn)定性
- 連續(xù)測量同一標(biāo)準(zhǔn)樣品(如1 mg/mL BSA溶液)至少6次，記錄吸光度值(如280 nm下誤差應(yīng)<±0.005 OD)；
- 檢查基線噪聲(通常要求<0.002 OD)以評估光路穩(wěn)定性。
2. 長期穩(wěn)定性
- 每月進(jìn)行一次全波長范圍(200-1000 nm)的基線掃描，觀察雜散光和波長重復(fù)性；
- 使用標(biāo)準(zhǔn)溶液周期性驗(yàn)證(如每周一次)，記錄偏差趨勢。
五、特殊注意事項(xiàng)
1. 基座清潔與維護(hù)
- 每次使用后用拭鏡紙擦拭基座，防止殘留蛋白或鹽結(jié)晶影響液柱形成；
- 定期檢查光纖探頭是否磨損，避免光損失。
2. 環(huán)境控制
- 實(shí)驗(yàn)室溫度需控制在20-25℃，濕度<60%，避免冷凝水干擾光學(xué)系統(tǒng)；
- 避開強(qiáng)電磁場(如離心機(jī)、微波爐)，防止信號噪聲。
3. 溯源性與合規(guī)性
- 校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)需具備NIST或ISO認(rèn)證，確保量值傳遞可靠性；
- 若用于臨床診斷或質(zhì)檢，需符合行業(yè)規(guī)范(如CLSI標(biāo)準(zhǔn)或藥典要求)。
